PCR儀的測序反應(yīng)試驗講解

　　1.取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，加入規(guī)定試劑。總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。將PCR管置于PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃10秒，50℃5秒，60℃4分鐘，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。

　　醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物：

　　1.將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中；

　　2.加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30min，小心棄上清；

　　3.加70%（V/V）的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10-15min。

　　電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理：

　　1.加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心；

　　2.將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心；

　　3.在PCR儀上進行熱變性（95℃2min），冰中驟冷，待上機。

　　具體上機操作按PCR儀說明書安裝毛細(xì)管，進行毛細(xì)管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動進樣，再預(yù)電泳（1.2kV，20min），在7.5kV下電泳2h。電泳結(jié)束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。

　　儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。

　　測序完畢按PCR儀操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。